Entre 1567 y 1616 se quemaron públicamente a 71 personas por sodomía en Sevilla.

Felipe, príncipe de Asturias, por
Tiziano, 1551.

Felipe II empeoró la situación de los homosexuales en España con su Pragmática de 1592, en la que, si bien no agrava las condenas que ya habían impuesto sus bisabuelos los Reyes Católicos, sí facilita los requerimientos de evidencia necesarios para la instrucción: a partir de ese momento un testigo basta.

Estas sentencias eran realizadas tanto por la corte en Madrid como por juzgados municipales como fue el caso en Málaga o Sevilla. Así por ejemplo entre 1567 y 1616 se quemaron públicamente a 71 personas por sodomía en Sevilla. En general, en la Corona de Aragón y Andalucía eran más laxos que en Castilla en la persecución de la homosexualidad. Incluso hay indicios de un gueto homosexual en Valencia.

Durante este siglo XVI, se debe resaltar que en el caso de las mujeres lesbianas algunos moralistas (por ejemplo, Antonio Gómez) señalaban que la sodomía entre mujeres mediante la utilización de un objeto era merecedora de hoguera, mientras que si no había objeto podía considerarse un atenuante que hiciera innecesaria la pena de muerte. Sin embargo, pocos eran los casos conocidos de sodomía entre mujeres sin el uso de un objeto. Un caso famoso fue el de Catalina de Belunza y Mariche, acusadas por el Fiscal General de San Sebastián de sodomía, y absueltas por el Tribunal Supremo Inquisitorial de Madrid tras la apelación.

[...] penetrarse entre sí como lo harían un hombre y una mujer desnudas, en la cama, tocándose y besándose, la una encima del vientre o la panza de la otra, un crimen que habían perpetrado en numerosas y diversas ocasiones.

Acusación del Fiscal General de San Sebastián en el caso de Catalina de Belunza y Mariche.